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生产感悟

 

来到生产一部细胞操作班已半年有余，在这之前曾在生产二部细胞操作班实习两个月，通过两个班的对比，发现有所不同之处是5L罐细胞的培养方式。一部5L罐细胞培养采用流加方式，二部5L罐细胞培养采用批培养方式。那么到底如何理解二者区别，把握二者细节，以便能更好的为生产服务呢？现将有关资料简单整理，供大伙分享、探讨。
分批培养是指将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生产，产物不断生成，经一段时间反应后将整个系统取出。
分批培养过程中细胞的生长可分为延滞期、对数生长期、减速期、平稳期、衰退期等几个阶段。延滞期是指细胞接种到细胞分裂繁殖这段时间。延滞期的长短依环境条件的不同而异，受种子细胞本身的影响。细胞的延滞期是其分裂繁殖前的准备时间。一方面细胞适应新的环境条件，另一方面，又不断积累细胞繁殖所必须的一些生物活性物质，使之达到一定浓度，进入对数生长期。细胞通过对数生长期迅速生长繁殖之后，由于环境条件的不断变化，如营养物质不足，抑制物的积累，细胞生长空间减少等原因，细胞经过减速期进入平稳期，这段时间内，细胞生长和代谢缓慢，细胞数基本维持不变。经过平稳期之后，由于环境条件恶化，有时也可能由于细胞本身遗传特性的改变，细胞逐渐进入衰退期而不断死亡，或由于细胞内某种酶的作用而使细胞发生自溶。
分批培养过程中细胞所处的环境随时间变化很大，不能使细胞自始至终处于最优条件下，根据细胞的这一生理特点，传代最好依据严格的时间进行，这样可以保持和监控细胞的增殖行为。若到了该传代的时间细胞还没达到足够的密度（即细胞没有彼此汇合）则应增加接种密度；相反，若细胞很快彼此汇合，则要降低接种密度。通过控制延滞期，将细胞的传代时间控制在对数生长的中期，一旦这一常规程序建立起来，在一定的接种密度下细胞的周期性生长将与培养时间和细胞产量相一致。批培养的成功与这一原理紧密结合。
流加培养是指先将一定量培养液装入反应器，在适应条件下接种细胞进行培养，细胞不断生长，产物不断生成。在此过程中，随着细胞对营养物质的不断消耗，新的营养成分不断补充至反应期内，使细胞进一步生长代谢，到反应终止时取出整个系统。
流加培养的特点就是能够调节培养环境中营养物质的浓度，一方面可以避免在某种营养成分的初始浓度过高时影响细胞的生长代谢及产物的形成，另一方面还能防止某些限制性营养成分在培养过程中被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成，这是流加培养和分批培养的明显不同，流加培养能使细胞处于一个相对稳定的状态。此外，在流加培养过程中，由于新鲜培养液的加入，因此整个过程的反应体积是变化的，这也是它的一个重要特征。
流加过程设计的第一步是选择和建立优化的基础培养基，在培养过程中根据细胞生长的需求，通过补加营养物质使其维持在一相对恒定浓度。
除营养物质的流加外，其它一些因素也可延长细胞培养时间，如低DO和较低培养温度（低于370C），在流加培养过程中这些因素都要综合考虑。
在流加培养中为了达到高细胞密度，最大程度减少副产物的积累是十分必要的。虽然不少策略可减少乳酸和氨的积累，但只有很少措施（如降低流加量）可以可靠地在大规模培养中实现。
流加培养的控制是流加培养成功的关键，由于动物细胞代谢的复杂性以及调节产物合成的机制分泌因子的作用了解不够深入，在动物细胞流加培养中关于检测和控制的研究较少，关于营养物的流加速率和流加时间等参数的优化都是凭经验完成。如NSO细胞培养中提高间歇流加频率使培养液中营养物浓度提高，最终单克隆抗体浓度提高，连续流加则不能进一步提高单抗浓度。但Noe等发现在流加培养中从每天补加改为连续流加，提高了单克隆抗体的浓度。BHK-21细胞株在种子细胞生长均一稳定的情况下，在设备功能与技术能力受限的情况下，采用何种流加方式能最大限度的提高细胞密度，并且细胞传代时正处于对数生长中期。简单点讲就是在什么时候流加，加多少保证细胞处于对数生长期，不影响到下一代的生长和繁殖，我没有找到相关的资料。希望我们能在此理论的指导下并与生产实际相结合，摸索出细胞流加培养的初始密度与初始培养体积、流加时间、流加量等相关的技术参数。
由于批培养操作简便，容易掌握，因而是一种最常用的操作方式，而流加培养方式操作简单可靠灵活，原则上胜过批培养。但作为一线的生产人员要在工作中善于观察、勤于思考，尤其在培养基或其它参数有所更改时，更应该做好每一批的观察记录，从中摸索出一个更适合生产，提高产能节约成本的经验值，使我们的产能和质量再跨一个新的台阶。